色水法在商业化生产中的应用（激光打孔 玻璃微滴管）CCIT

02 色水法检漏原理

商业化生产的色水法检漏机一般与灭菌柜一体，在灭菌结束后直接进行检漏，其基本原理是通过对样品进行加压减压处理、在样品内外制造压差从而使色水在压差作用下进入样品。一般，在条件比较严苛的条件下，色水法灵敏度（100%检出的孔径）可以达到3µm

03 色水法适应范围

色水法只适合玻璃安瓿的检测，塑料安瓿由于清洗困难，并不适合色水法检漏。无色安瓿和棕色安瓿均可以使用，但棕色安瓿比无色安瓿检测条件要相应的更苛刻一些。另外由于色水法需要灯检，一些需要避光保存的样品无法使用色水法检测。

04 色水法灵敏度的影响因素

色水法作为一种概率性方法，试验过程中的诸多因素都会影响其灵敏度，主要影响因素有：

1. 色水法试验条件：染色剂种类、浓度、真空度/保持时间、压力/保持时间；

2. 制剂的特点包括包材的颜色、制剂的颜色、制剂的规格、制剂的成分、粘稠度等等；

3. 目视法检测人员对颜色的敏感度等主官因素。

这些因素往往并不是独立产生影响，而是需要综合来看，比如染色剂种类，除了要考虑染色剂本身的显色性能、染色液的表明张力、清洗的难易程度，还要考虑染色剂和包材颜色以及制剂性质的相容性，需要选择与制剂具有相容性的染色剂种类。另外，样品规格的影响也是多方面的。

一般情况下，可在线上验证之前，采用线下设备对色水条件进行初步摸索，确定好色水浓度、压力条件和保持时间这些条件，然后进一步将方法转移至线上设备。如果要达到3µm的灵敏度，色水浓度至少需在0.01%以上，当然高的色水浓度也会相应的增加清洗难度。依据现有经验来看，不同染色剂清洗难度并不相同，在方法摸索阶段，针对清洗难度进行染色剂筛选是有必要的。

05 阳性样品打孔位置考虑

每一种检测方法都会涉及打孔位置的考虑，我们在考虑打孔位置的时候，应该秉持“风险评估”的原则，即首先分析制剂本身的泄漏风险，而风险又可以从风险点的位置和风险类型去考虑。对于安瓿来说，主要泄漏风险位置在熔封部位，其次，瓶颈可能存在的一些肉眼不易察觉的裂痕，这两个点的泄漏风险类型均为气漏（色水法检漏一般样品正置，漏点位于制剂液面以上，抽真空时顶空气体从泄漏位点逸出，本文称为气漏）。如果还要更加全面的去关注风险，可以考虑一些风险低的部位，如瓶子底部或者瓶身部位，这些漏点的泄漏类型为液漏。

色水法作为一种整体检漏方法，阳性样品孔径一旦经过计量被确定，其结果只跟泄漏类型有关、与泄漏位置无关，因此，在考虑打孔位置时，可以主要考虑在气漏部位打孔，辅以液漏部位，并不需要非要定点制备在熔封部位和瓶颈，这是整体检漏方法与定点检漏方法的区别。

气漏和液漏阳性样品的检测灵敏度会有一定的差异性，差异性的大小与很多因素有关。一般而言，只要色水浓度、压力条件和保持时间合适，不管是无色安瓿还是棕色安瓿，色水法可以100%检出3µm的泄漏。

06 线上色水检测其他需要考虑的问题

1、环境污染问题

色水法在密封性检测中已经有很长的应用历史，但是由于在相应的法规出台之前，大家往往只关注较大的泄漏，使用的色水浓度都比较低，色水使用后通过污水直接排放。色水法灵敏度提高的关键因素之一是色水浓度，当将色水浓度提高至0.01%甚至更高的情况下，色水的排放变成了一个非常严重的环境污染问题。从笔者接触的一些药企反映，色水很少会进行重复性利用，即便是重复性利用，利用次数也有限，原因之一是色水使用之后浓度往往会被稀释，浓度降低；另外一个重要原因是配制色水的水是一般的纯化水，并没有严格的微生物控制，在放置一段时间之后，水中的微生物增加明显使得色水不具有重复利用的可能。

目前色水法申报的合规性一般通过将其与微生物挑战法关联获得，即要求其灵敏度与微生物挑战法相当或者高于微生物挑战法，而微生物挑战法灵敏度与挑战条件相关，在法规没有对微生物挑战条件进行规定的前提下，色水法的灵敏度要求也变得模糊，而高的灵敏度意味着更高的色水浓度，更多的环境污染。

2、色水检漏引起的染菌风险

色水检漏法另一个需要关注的问题是色水检漏是在灭菌之后进行，虽然整个过程在灭菌柜中进行，但整个色水体系并不是无菌的，配制色水所使用的纯化水并非无菌水，这也意味着色水本身含有微生物，而色水检漏本身有一定的灵敏度，假设检漏灵敏度为5µm，这就意味着低于5µm的漏孔是无法被检出的，而在漏孔高于0.3µm时有通过液体激发微生物进入的风险，如果样品存在低于5µm的漏孔，由于在色水检漏过程中经历了抽真空/加压这些剧烈的条件，是否会因此增加微生物侵入的风险？毕竟一般药品在生命周期中只会接触空气中的微生物，也不会经历这样严苛的条件，由液体激发的微生物侵入风险比较低。

这个问题是由药企的资深人员提出，笔者也配合他们做了相应的研究。我们通过在阳性样品中罐装培养基，将其浸没在纯化水中按照色水法的条件进行抽真空/加压处理，处理之后再进行培养，观察阳性样品染菌情况。试验结果表明在纯化水中微生物含量为50cfu/ml时，3µm、5µm的阳性样品均没有长菌，而10µm的阳性样品有20%的侵入概率。而色水法本身可以将5µm、10µm的泄漏100%检出，综合来看，通过控制纯化水中微生物含量、提高色水检漏的灵敏度，可以控制色水法引起的染菌风险。一般3µm的泄漏在色水法检漏中色水进入的量在5µl-10µl左右（经验值，仅供参考），在纯化水中微生物含量为50cfu/ml时，其侵入量仅为≤0.5 cfu，故其染菌的风险比较低。这也意味着如果染色液重复使用会导致其中微生物含量增加的话，色水检漏引起的微生物进入风险也会相应的增加。

3、色水检漏验证要不要验证灭菌过程？

色水检漏是在灭菌柜中进行的，在灭菌结束之后运行检漏程序，那么使用阳性样品验证检漏过程是不是要经历灭菌过程？这个问题可以从“要验证”与“不需要验证”两个角度去评估验证过程的合理性。

首先，秉持要验证灭菌过程的观念评估的是在灭菌之前样品存在的泄漏，所以认为阳性样品应当和样品一样经历灭菌，这样才能模拟真实情况，但阳性样品经历灭菌过程其孔径会发生变化，这种变化除了与灭菌条件有关，还与制剂的成分、性质有关。粘稠的制剂在灭菌过程容易堵塞漏孔，制剂成分在高温高压条件下对于漏孔的腐蚀也可能导致漏孔堵塞，高温高压环境的变化有可能导致漏孔变大，这诸多因素的影响使得灭菌后阳性样品的孔径变化难以预估，所以，检漏验证容易出现不可预期的结果。

其次，如果不进行灭菌、只进行检漏验证评估的则是在灭菌之后样品存在的泄漏，而这些泄漏也是将来在样品生命周期中存续的泄漏。由于没有上述因素的影响，试验结果会呈现随着孔径增大染色概率逐渐升高的趋势。个人认为检漏验证不进行灭菌更好一些，因为灭菌和检漏是两个完全独立的过程行使的是不同的功能，我们对于检漏的验证是验证仪器检出泄漏的能力，应该排除灭菌过程对于孔径变化的干扰，而我们真正要评估的泄漏风险也是灭菌之后样品可能存在风险，而不是灭菌之前。